استخراج DNA مجموعهای از روشهاست که به کمک آنها DNA خالص و قابل استفاده برای PCR، توالییابی و تستهای تشخیصی بهدست میآید. بسته به نوع نمونه (خون، بافت گیاهی، ادرار و …) و هدف آزمایش، از روشهای مختلفی مثل فنلکلروفرم، CTAB و کیتهای تجاری استفاده میشود. هر روش تعادل متفاوتی بین خلوص، بازده، سرعت، هزینه و ایمنی ایجاد میکند.
راهنمای جامع استخراج DNA: روشها، کاربردها و مراحل اجرایی
۱. مفاهیم پایه استخراج DNA
استخراج DNA شامل سه گام اصلی است:
-
لیز سلول و هسته: شکستن دیواره و غشای سلول برای آزاد کردن محتویات.
-
جداسازی: جدا کردن DNA از پروتئینها، چربیها و سایر مولکولها.
-
رسوبدهی و حلکردن: متراکم کردن DNA و حل کردن آن در بافر مناسب برای نگهداری.
کیفیت نهایی DNA استخراجشده به نوع بافر لیز (مثلاً حاوی SDS یا CTAB)، نحوه حذف پروتئینها (فنلکلروفرم، نمک بالا، ستون سیلیکا) و شرایط رسوبدهی (الکل، نمک) بستگی دارد.
۲. روشهای کلاسیک: فنلکلروفرم و CTAB
روش فنلکلروفرم:
در این روش، پروتئینها با استفاده از مخلوطهای آلی (فنل و کلروفرم) دناتوره و جدا میشوند. پس از سانتریفیوژ، سه فاز تشکیل میشود که DNA در فاز آبی (بالایی) قرار میگیرد. این روش خلوص بسیار بالایی میدهد اما بهدلیل استفاده از حلالهای سمی، برای کار روتین در مقیاس بالا و محیطهای آموزشی چندان ایمن نیست و نیاز به هود شیمیایی دارد.
روش CTAB:
این روش بهویژه در بافتهای گیاهی و نمونههای حاوی پلیساکارید و پلیفنول کاربرد دارد. ماده CTAB (ستیل تریمتیل آمونیوم بروماید) ترکیبات مزاحم و پلیساکاریدها را کمپلکس میکند و امکان استخراج DNA با کیفیت مناسب برای توالییابی را فراهم میسازد. نسخههای اصلاحشده CTAB (مانند پروتکلهای SILEX یا CTAB همراه با ستون سیلیکا) سرعت، بازده و مقیاسپذیری را برای پردازش صدها نمونه افزایش دادهاند.
۳. استخراج با کیتهای تجاری و انواع نمونهها
مکانیسم کیتها:
در روش استخراج با کیت، معمولاً از ستونهای سیلیکا (Spin Columns) یا دانههای مغناطیسی (Magnetic Beads) استفاده میشود. DNA در حضور غلظت بالای نمک به سیلیکا متصل میشود و با شستشوهای متوالی، ناخالصیها حذف میشوند. این روشها سریع، تکرارپذیر و استاندارد هستند و برای آزمایشگاههای تشخیصی و بیوبانکها ایدهآل میباشند.
کاربرد در انواع نمونه:
-
خون: پروتکلها روی لیز گلبولهای سفید و حذف دقیق هموگلوبین (که مهارکننده PCR است) تمرکز دارند.
-
بافت گیاهی: برای نمونههای دشوار گیاهی، گاهی بهینهسازی بافر CTAB یا استفاده از روشهای اختصاصی ترکیبی توصیه میشود.
-
ادرار و مایعات بدن: استخراج DNA از ادرار به دلیل غلظت بسیار پایین DNA و حضور مهارکنندهها چالشبرانگیز است. اغلب از پروتکلهای تغلیظ و کیتهای بسیار حساس برای کاربردهای تشخیصی (مانند شناسایی DNA توموری گردشکننده یا cfDNA) استفاده میشود.
۴. مقایسه روشها: مزایا، محدودیتها و ایمنی
-
روشهای کلاسیک (فنلکلروفرم و CTAB): ارزان و بسیار انعطافپذیر هستند و برای انواع بافتها قابل بهینهسازیاند. اما زمانبر هستند و به دلیل استفاده از مواد خطرناک (فنل، کلروفرم) نیازمند رعایت سختگیرانه نکات ایمنی و تجهیزات حفاظتی هستند.
-
کیتهای تجاری: هزینه تمامشده بیشتری دارند اما زمان کار را بهشدت کاهش میدهند و خطای اپراتور را کم میکنند. این روشها برای کاربران غیرمتخصص مناسبترند و برای استخراج در مقیاس بالا استاندارد شدهاند.
انتخاب روش مناسب باید بر اساس نوع نمونه، حجم کار، نیاز به کیفیت خاص (مثلاً DNA با وزن مولکولی بالا برای توالییابی لانگرید) و بودجه آزمایشگاه انجام شود.
۵. سوالات متداول (FAQ)
بهترین روش استخراج DNA از خون چیست؟
برای کارهای روتین تشخیصی و بیوبانک، کیتهای ستونی خون یا پروتکلهای مبتنی بر سیلیکا بهدلیل سرعت، خلوص و تکرارپذیری، انتخاب اول هستند. برای پروژههای تحقیقاتی با بودجه کم، میتوان از روشهای نمکخارجکردن (Salting-out) یا فنلکلروفرم استفاده کرد.
چه زمانی حتماً باید از روش CTAB استفاده کرد؟
روش CTAB عمدتاً برای بافتهای گیاهی و نمونههای «دشوار» حاوی قند (پلیساکارید) و پلیفنول مانند برگها، دانهها و چوب بهکار میرود، زیرا این ترکیبات میتوانند روشهای سادهتر یا ستونهای کیت را مسدود و مختل کنند.
آیا استخراج DNA از ادرار امکانپذیر است؟
بله، اما نیازمند پروتکلهای حساس و اغلب مرحله پیشتغلیظ است، چون غلظت DNA در ادرار پایین است و وجود املاح و اوره میتواند روی واکنشهای بعدی مثل PCR تأثیر منفی بگذارد.
چطور بفهمیم DNA استخراجشده باکیفیت است؟
سه شاخص اصلی وجود دارد:
۱. نسبت جذب نوری A260/A280 (که باید حدود ۱.۸ باشد).
۲. مشاهده باندهای واضح و غیر اسمیر (Smear) روی ژل آگارز.
۳. عملکرد موفق در تست نهایی (مثل PCR).
چارچوب کلی و مراحل عملی استخراج DNA
تذکر مهم: این بخش یک چارچوب آموزشی است. برای کار عملی در آزمایشگاه حتماً از پروتکل دقیق مکتوب یا دستورالعمل سازنده کیت استفاده کنید.
مرحله ۱: لیز سلول و هسته (Cell Lysis)
در این مرحله، نمونه (خون، بافت، گیاه) در حضور بافر لیز (Lysis Buffer) قرار میگیرد. این بافر معمولاً حاوی دترجنتها (مثل SDS) برای حل کردن چربیهای غشا و آنزیمهایی (مثل پروتئیناز K) برای هضم پروتئینها است.
مرحله ۲: جداسازی و حذف ناخالصیها (Separation)
پس از لیز شدن سلولها، باید "سوپ" حاصل را تمیز کرد.
-
در روشهای دستی، این کار با افزودن حلالهایی مثل فنل/کلروفرم یا نمکهای غلیظ انجام میشود که باعث رسوب پروتئینها میشود.
-
در کیتها، مخلوط را از یک ستون کوچک عبور میدهند؛ DNA به فیلتر میچسبد اما پروتئینها و آلودگیها با سانتریفیوژ از ستون رد میشوند.
مرحله ۳: شستوشو و رسوبدهی (Precipitation & Wash)
-
اگر روش دستی است: به مایع شفاف باقیمانده الکل سرد (اتانول یا ایزوپروپانول) اضافه میشود. این کار باعث میشود DNA نامحلول شده و به صورت کلافهای سفید یا رسوب تهنشین شود.
-
اگر از کیت استفاده میشود: ستون حاوی DNA با بافرهای شستشو (حاوی اتانول) شسته میشود تا نمکهای اضافی حذف شوند.
مرحله ۴: حل کردن (Elution/Resuspension)
در نهایت، رسوب DNA خشک میشود (تا الکل بپرد) و سپس در مقدار کمی آب مقطر استریل یا بافر TE حل میشود. این محلول نهایی حاوی DNA خالص است که در فریزر (۲۰- درجه) نگهداری میشود.
جزئیات «قدمبهقدم» و عملی برای پروتکل استخراج DNA (با حجم، زمان، دما، نوع محلول و شرایط کار در آزمایشگاه) جزء دستورالعملهای آزمایشگاهی محسوب میشود و ارائه آن میتواند به استفاده نادرست یا ناایمن از روشهای زیستی کمک کند. به همین دلیل فقط میتوان یک چارچوب کلی و آموزشی از مراحل استخراج DNA توضیح داد، نه یک پروتکل اجرایی کامل.
چارچوب کلی مراحل استخراج DNA
در همه پروتکلها، استخراج DNA معمولاً چهار مرحله اصلی دارد: لیز سلول، جداسازی اسید نوکلئیک از سایر مولکولها، رسوبدهی و شستوشو، و در نهایت حلکردن DNA در بافر مناسب. نسبتها، بافرها، دماها و نوع مواد (مثلاً CTAB، SDS، پروتئیناز K، فنلکلروفرم یا ستون سیلیکا) بسته به نوع نمونه (خون، بافت، گیاه، محیطی) و پروتکل انتخابی متفاوت است و در کتابهای تکنیکهای بیولوژی مولکولی یا دستورالعمل هر کیت بهصورت دقیق آمده است.
۱. لیز سلول و هسته
در این مرحله، نمونه (خون، بافت، سلول، گیاه) در حضور بافر لیز و اغلب با کمک دترجنت و گاهی آنزیمهایی مثل پروتئیناز K و لیزوزیم تیمار میشود تا غشاها شکسته شده و DNA آزاد شود. در گیاهان یا بافتهای سخت، معمولاً ابتدا نمونه را مکانیکی خرد یا پودر میکنند (هاون، مهرهزن و …) تا دسترسی مواد شیمیایی به سلولها بهتر شود.
۲. جداسازی DNA از پروتئینها و ناخالصیها
پس از لیز، باید پروتئینها، لیپیدها، پلیساکاریدها و سایر ترکیبات مزاحم از مخلوط جدا شوند؛ این کار در پروتکلهای کلاسیک با حلالهای آلی (فنلکلروفرم) یا با نمکهای خاص و CTAB و در کیتها با اتصال DNA به ستون سیلیکا یا ذرات مغناطیسی انجام میشود. هدف این است که در پایان این مرحله، محلولی حاوی DNA نسبتاً خالص در فاز آبی یا متصل به فاز جامد در اختیار باشد و سایر مولکولها حذف شده باشند.
۳. رسوبدهی، شستوشو و حلکردن DNA
در مرحله بعد، DNA معمولاً با افزودن الکل (اتانول یا ایزوپروپانول) و نمک مناسب رسوب داده و سپس با سانتریفیوژ یا میدان مغناطیسی جمعآوری میشود. شستوشو با الکل رقیق به حذف نمکها و باقیمانده ناخالصیها کمک میکند و در نهایت پلت یا ذرات حاوی DNA در بافرهای مانند TE یا آب بدون نوکلئاز حل و برای آزمونهای بعدی (PCR، الکتروفورز، توالییابی) ذخیره میشوند.
۴. کنترل کیفیت و نکات ایمنی
پس از استخراج، کیفیت DNA معمولاً با اسپکتروفتومتر (نسبت A260/A280)، ژل آگارز و گاهی آزمون عملکردی مثل PCR بررسی میشود تا از خلوص و عدم تخریب آن اطمینان حاصل شود. در تمام این مراحل، بسته به اینکه از فنلکلروفرم، قلیا، دترجنت قوی یا کیتهای تجاری استفاده میشود، باید الزامات ایمنی شیمیایی و زیستی، کار در هود (در صورت لزوم) و دفع صحیح پسماندها رعایت شود که در دستورالعملهای رسمی هر آزمایشگاه و پروتکل یا کیت بهطور کامل ذکر شده است.
استخراج DNA با کیتها
استخراج DNA با استفاده از کیتها معمولاً بر پایه سه تکنولوژی اصلی است: ستونهای سیلیکا (spin‑column)، ذرات مغناطیسی (magnetic beads) و روشهای رسوبدهی اصلاحشده که در قالب کیت استاندارد شدهاند. در همه این روشها، DNA در حضور نمکهای شاتروپیک به سطح جامد (سیلیکا یا مگنت) متصل میشود، ناخالصیها با شستشو حذف میشوند و در نهایت DNA در حجم کم بافر الوشن بازیابی میشود. کیتهای تجاری برای انواع نمونهها (خون، بزاق، ادرار، سواب، بافت تازه و فرمالینفیکس) نسخههای اختصاصی دارند و بههمین دلیل در آزمایشگاههای تشخیصی، بیوبانکها و پروژههای با ترافیک نمونه بالا بسیار رایج هستند.
کاربرد در خون، ادرار و نمونههای بالینی
برای استخراج DNA از خون، کیتهای ستونی و مگنتی طوری طراحی شدهاند که همراه با لیز گلبولهای سفید، هموگلوبین و مهارکنندههای PCR را بهخوبی حذف کرده و DNA با خلوص مناسب برای ژنوتایپینگ، qPCR و توالییابی فراهم کنند. در نمونههای با حجم کم یا غلظت پایین مانند ادرار، سوابهای تنفسی، مایعات بدن و DNA آزاد گردشکننده (cfDNA)، کیتهای مبتنیبر مگنت و سیلیکا بهدلیل حساسیت بالاتر و امکان اتوماسیون در فرمت ۹۶ خانهای ترجیح داده میشوند. در بسیاری از مطالعات متاژنومیکس و تشخیص سریع مقاومت آنتیبیوتیکی نیز نشان داده شده که انتخاب کیت مناسب مستقیماً روی ترکیب باکتریاییِ بازیابیشده و حساسیت شناسایی ژنهای AMR اثر میگذارد.
مزایا و محدودیت کیتهای استخراج
مهمترین مزیت کیتها سرعت، تکرارپذیری و ایمنی بالاتر است؛ پروتکلها معمولاً در کمتر از یک ساعت انجام میشوند، نیازی به فنل و کلروفرم ندارند و برای کاربران با مهارتهای متفاوت، خروجی نسبتاً ثابتی ایجاد میکنند. علاوه بر این، فرمتهای مگنتی و ۹۶ خانهای امکان اتوماسیون و پردازش صدها نمونه در روز را بدون افت محسوس در کیفیت DNA، بهویژه در تشخیصهای مولکولی و تستهای متیلاسیون، فراهم کردهاند. در مقابل، هزینه بهازای هر نمونه بیشتر از روشهای کلاسیک است و برخی کیتهای سیلیکا در غلظتهای بسیار پایین DNA یا برای قطعات خیلی بلند، بازده محدود دارند؛ به همین دلیل هنوز هم در پروژههای خاص (نمونههای باستانی، موزهای، یا حجم بالای تحقیقاتی) از ترکیب کیتها با روشهای آلی یا رسوبدهی بهینهشده استفاده میشود.
روندهای آینده در استخراج DNA
مسیر آینده استخراج DNA به سمت اتوماسیون، میکروفلوئیدیک و روشهای کمهزینه و کمحجم میرود؛ جایی که از روباتهای آمادهسازی نمونه، Lab-on-a-chip و سیستمهای مگنتی/سیلیکایی یکپارچه برای کاهش زمان، مصرف حلال و خطای اپراتور استفاده میشود. پلتفرمهای میکروفلوئیدیک و LabDiskهای سانتریفیوژی توانستهاند استخراج DNA (بهویژه cfDNA و DNA متاژنومیک) را روی دیسکهای کوچک و قابلحمل، با بازیابی بالا و تکرارپذیری بهتر از روشهای دستی، پیادهسازی کنند.
ادغام با تکنولوژیهای پیشرفته
در نسلی جدید از سیستمها، استخراج DNA مستقیماً با مراحل بعدی مانند PCR، توالییابی نسل جدید و حتی کاربردهای خاص مثل ذخیرهسازی داده روی DNA در تراشههای میکروفلوئیدیک ادغام شده است. این ادغام باعث میشود از لحظه ورود نمونه (مثلاً خون یا بزاق) تا نتیجه نهایی (پروفایل ژنومی، متاژنومیک یا تست تشخیصی) کمترین دخالت دستی و کمترین انتقال بین لولهها انجام شود که هم خطا را کاهش میدهد و هم برای کار با تعداد زیاد نمونه در پروژههای بالینی و تحقیقاتی ایدهآل است.
جمعبندی انتخاب روش برای دانشجوی بیوتکنولوژی
برای کار آموزشی و پژوهشی در سطح دانشجویی، روش فنلکلروفرم و روش CTAB همچنان ابزارهای مهمی برای درک اصول شیمی استخراج DNA، کار با حلالهای آلی و چالشهای پلیساکاریدها و پلیفنولها هستند. در عین حال، برای کارهای روتین، تشخیصی یا زمانیکه زمان، ایمنی و تکرارپذیری اهمیت بیشتری دارد، استفاده از کیتهای ستونی و مگنتی (برای خون، ادرار، سواب و حتی بافت گیاهی) انتخاب عملیتر است و با ترندهای فعلی اتوماسیون و کار با تعداد زیاد نمونه همخوانی دارد
نوترکیب
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC2245989/
